FastKing RT Kit (Bi gDNase)

ARN-A-1 xera dibe

—— RNA -ya qalind bêyî paqijiyê paqij bikin. Pêdivî ye ku materyalê ku ARN jê tê derxe heya ku ji dest tê hilweşandina ARN -yê nû be. Berî reaksiyona RT, yekseriya ARN -ya li ser gelika denaturkirî analîz bikin. Piştî derxistina RNA, divê ew di% 100 formamide de were hilanîn. Ger astengkerê RNase were bikar anîn, pêdivî ye ku germahiya germkirinê <45 ° C be, û pH jî divê ji 8.0 kêmtir be, wekî din astengker dê hemî RNase ya girtî berde. Digel vê yekê, divê astengkerê RNase di çareseriyên ku ≥ 0.8 mM DTT hene de were zêdekirin.

ARN-A-2 astengkerên reaksiyonên veguheztina berevajî vedigire

—— Astengkerên veguheztina berevajî de SDS, EDTA, glycerol, pyrophosphate sodium, spermidine, formamide, xwê guanidîn, hwd. Barana ARN bi 70% (v/v) etanolê bişon da ku înhîbîtoran jê bibin.

A-3 Annealing têrker a destpêkên ku ji bo sentezkirina xeta yekem a cDNA tê bikar anîn

—— Bipejirînin ku germahiya germkirinê ji bo destpêkên ku di ezmûnê de têne bikar anîn guncan e. Ji bo hexamerên rasthatî, tê pêşniyar kirin ku berî ku hûn bigihîjin germahiya reaksiyonê germê li 25 ° C 10 hûrdemî bigirin. Ji bo destpêkên gen-taybetî (GSP), GSP-yên din biceribînin, an jî bi oligo (dT) an hexamerkek bêhempa ve biçin.

A-4 Mêjera hindik a ARNya destpêkê

—— Hejmara ARN zêde bike. Ji bo nimûneyên ARN ji 50 ng kêmtir, 0.1 μg heta 0.5 μg acetyl BSA dikare di senteza cDNA ya rêza yekem de were bikar anîn

A-5 Risteya hedefê di tevnên analîzkirî de nayê îfadekirin.

—— Destmalên din biceribînin.

Reaksiyona A-6 PCR têk diçe

——Ji bo RT-PCR-ya du-gavî, şablona cDNA-ya di pêngava PCR-ê de nikare ji 1/5 ya qebareya reaksiyonê derbas bike.

A-1 Annealing ne-taybetî ya destpêk û şablonan

——Dema 3'-ya seretayan divê 2-3 dG an dC nebe. Di senteza stranda yekem de pêşgirên taybetî-Gene bikar bînin li şûna destpêkên an olîgoyê (dT). Di çend dewreyên pêşîn de germahiyek zexîreyê bilindtir bikar bînin, û dûv re jî germahiyek nizmtir bikar bînin. Ji bo PCR polîmeraza Taq DNA ya destpêkî ya germ ji bo PCR bikar bînin ku taybetmendiya reaksiyonê baştir bikin.

A-2 Sêwirana belengaz a destpêkên gen-taybetî

—— Ji bo sêwirana seretayî ya amplification heman prensîban bişopînin.

ARN-A-3 bi DNAya genomîk vegirtî ye

—— RNA bi PCR-pola DNase I. re derman bikin Ji bo tespîtkirina qirêjiya DNA reaksiyonek kontrolê bêyî transkrîpsiyona berevajî saz bikin.

A-4 Damezrandina dimer a seretayî

—— Destpêkên sêwiranê bêyî rêzikên tevhevker di dawiya 3 ’de dîzayn bikin.

A-5 Mg pir zêde²⁺ lisersekinî

—— Mg Optimize bike²⁺ berhevkirina ji bo her şablon û kombînasyona seretayî

A-6 Bi DNAya biyanî vegirtî ye

—— Serişteyên aerosol-berxwedêr û enzîmên UDG bikar bînin.

A-1 Naveroka hilbera stranda yekem pir zêde ye

—— Di pêngava kevneşopî ya berteka PCR -ê de mîqdara hilbera yekem kêm bikin.

A-2 Di reaksiyona PCR de mîqdara destpêker pir zêde ye

—— Ketina seretayî kêm bikin.

A-3 Çerxên pir zêde

—— conditionsert û mercên reaksiyona PCR xweş bike û jimara çerxa PCR kêm bike.

A-4 Germahîya germkirinê pir kêm e

—— Germahiya anînê zêde bikin da ku pêşî li destpêbûn û dirêjkirina ne-taybetî bigirin.

A-5 Amplifikasyona ne-taybetî ya perçeyên oligonucleotide ku ji hêla hilweşîna DNase ya DNA ve hatî çêkirin--RNA-ya hêja derxînin da ku pêşî li vegirtina DNA bigirin.

RT-PCR ev e ku meriv ARN-yê veguhezîne nav cDNA-yê, û dûv re jî cDNA-ya berevajîkirî wekî şablonek ji bo reaksiyona PCR-ê bikar bîne da ku perçeya mebestê zêde bike. Li gorî şert û mercên taybetî yên ezmûnê an destpêkên bêserûber, Oligo dT û destpêkên taybetî yên gen hilbijêrin. Hemî destpêkerên jorîn dikarin ji bo mRNA hucreya eukaryotî ya kurt bêyî avahiya porê were bikar anîn.

Destpêka tesadufî: Ji bo ARNya dirêj a bi avahiya porê, û hem jî ji bo her celebên ARNyê yên wek rRNA, mRNA, tRNA, hwd. Ji bo berteka RT-PCR ya şablonê yekane têne bikar anîn.

Oligo dT: Ji bo ARN -ya bi dûvika PolyA -yê maqûl e (ARN -ya prokaryotî, rukuza eukaryotî -dT -rRNA û tRNA dûvikên PolyA -yê nînin). Ji ber ku Oligo dT bi dûvika PolyA ve girêdayî ye, qalîteya nimûneyên ARN-yê hewce ye ku bilind be, û tewra piçûkek hilweşandinê jî dê mîqyasa senteza cDNA-ya tev-dirêj pir kêm bike.

Destpêka taybet a Gene-yê: Bi rêzika şablonê re tevhevker e, ji bo rewşên ku rêzika mebest tê zanîn guncan e.

Du rê hene:

1. Rêbaza referansa navxweyî: Di teoriyê de, cDNA perçeyên DNA yên bi dirêjahiya cihê ne, ji ber vê yekê encama elektroforezê şil e. Ger pirbûna ARN kêm be, dê tu hilberek di elektroforezê de neyê xuyang kirin, lê ev nayê vê wateyê ku dê tu hilberek ji hêla PCR ve neyê zêdekirin. Bi gelemperî, referansa navxweyî dikare ji bo tespîtkirina cDNA were bikar anîn. Ger referansa navxweyî encam bigire, qalîteya cDNA dikare bi bingehîn were misoger kirin (di çend rewşan de, ger perçeya genê mebest pir dirêj be, dibe ku îstîsna hebin).

2. Ger genek naskirî ya ku ji hêla vê şablonê ve hatî zêdekirin hebe, ew dikare ji hêla destpêkên vê genê ve were verast kirin. Zêdekirina referansa navxweyî nayê vê wateyê ku bi cDNA re pirsgirêk tune. Ji ber ku referansa navxweyî di cDNA de pirrjimariyek heye, mezinkirina wê hêsan e. Ger cDNA bi sedemên cihêreng qismî were xirab kirin, ji perspektîfa îhtîmalê, dê encamên PCR -ê yên genên hedef pir kêm kêm pir bandor bibin. Digel ku referansa navxweyî hîn jî di pirjimariyê de ye, dibe ku zêdebûn neyê bandor kirin.

Beşek ji ARN xera dibe. Yekparetiyê kifş bikin û RNA paqij bikin

Dibe ku naveroka ARN -ya celebên cihêreng cûda be, lê bi gelemperî, divê ARN -ya giştî ya hatî derxistin du bendên 28S û 18S yên zelal di elektroforeza gel de hebin, û geşiya banda berê divê du carî ji ya ya paşîn zêdetir be. Benda 5S destnîşan dike ku ARN xera bûye, û şewqa wê bi radeya çikbûnê re têkildar e. Amplifikasyona serfiraz a referansa navxweyî nayê vê wateyê ku bi ARN re pirsgirêk tune, ji ber ku referansa navxweyî pir zêde ye, RNA dikare were zêdekirin heya ku xirabbûn ne dijwar be. The OD₂₆₀/OD₂₈₀Rêjeya ARNya paqij a ku bi spektrofotometre tê pîvandin divê di navbera 1.9 û 2.1 de be. Hejmarek piçûktir qirêjiya proteînê ya di ARN de dê rêjeyê kêm bike. Heya ku nirx pir kêm nebe, RT nayê bandor kirin. Ya ku ji bo RT -ê herî girîng girîng e yekitiya RNA ye.

Berfirehkirina genê referansa navxweyî tenê dikare destnîşan bike ku RT bi ser ketiye, lê ew ne hewce ye ku bi kalîteya xeta cDNA re têkildar be. Ji ber ku perçeyên referansa navxweyî bi gelemperî bi mezinahî piçûktir in û di vegotinê de bilind in, di transkrîpsiyona berevajî de serketîbûna wan hêsantir e. Lêbelê, mezinahî û vegotina genê mebest ji genê heya genê diguhere. Qalîteya cDNA tenê bi referansa navxweyî nayê darizandin nemaze ji bo perçeyên armancê ku ji 2 kb dirêjtir in.

Hin nimûneyên xwedî strukturên navîn ên tevlihev in, an naveroka GC -ya wan dewlemend e, an jî bi pirbûna hindik hêja ne. Di van rewşan de, divê transkrîptasa berevajî ya guncan li gorî mezinahiya perçeya mebest û mînakê were hilbijartin. Ji bo şablonên RNA yên bi naveroka GC ya bilind û avahiya navîn a tevlihev, dijwar e ku meriv avahiya duyemîn li germahiyek nizm, an bi transkrîptaza berevajî ya hevpar veke. Ji bo van qaliban, Quant Reverse Transcriptase dikare were hilbijartin, ji ber ku performansa wê ya veguheztina berevajî eşkere ye ku ji ya transkrîptaza berevajî ya rêza M-MLV çêtir e, ku dikare şablonên RNA-yên cihêreng bi rengek bikêr veguhezîne û RNA-yê di rêza yekem a cDNA-yê de heya radeya herî zêde veguhezîne. Dema ku kîteya transkrîpazê ya berevajî ya gelemperî tê bikar anîn, pergala 20 μl tenê dikare 1 μg ya RNA ya tevayî tenê bi bandor veguhezîne. Ji kerema xwe bala xwe bidin kapasîteya herî zêde ya RT ya kîtê. Ger şablon zêde were zêdekirin, veguheztina berevajî dê bi pirrbûna RNA re bibe alîkar. Ji ber vê yekê, çêtir e ku meriv ji kapasîteya herî zêde ya pergalê derbas neke.

A-1 Diyar bikin ka ARN bi giranî tê xirab kirin û gelo RT serketî ye

Bi gelemperî, sedema têkçûna amplifikasyona referansa navxweyî bi gelemperî ji hêla xirabkirina RNA -ya cidî ve dibe. Sedemek din a gengaz têkçûna paşvekişandinê ye. Referansa navxweyî nabe ku wekî standardek were darizandin da ku qalîteya yek xêza cDNA -yê dadbar bike, lê ew dikare wekî standardek were bikar anîn da ku were darizandin gelo ger pirsgirêka kalîteya RNA -yê tune be transkrîpsiyona berevajî serketî ye. Di pêvajoya veguheztina berevajî de ya herî girîng ev e ku meriv germahiyek domdar û pergalek reaksiyonê ya domdar biparêze da ku karîgeriya reaksiyonê baştir bike.

A-2 Diyar bikin ka destpêkên ji bo zêdekirina genên referansa navxweyî pêbawer in û gelo di reagentên ku di PCR de têne bikar anîn pirsgirêk hene.

Ji bo jimartina têkildar, divê ARN berî veguheztina berevajî were pîvandin, ku ev jî di gelek kîtên veguheztina berevajî de hewce ye, mînakî, têketina RNA -yê wekî 1 μg binirxînin. Ji ber ku cDNA ya ku berevajî hatî veguheztin çareseriyek tevlihev e, di nav de RNA, oligo dT, enzîm, dNTP, û tewra hindik mayîna DNA jî, dê devjêberdan çêbibe, ji ber vê yekê ne mumkun e ku cDNA bi rengek rast were hejmartin. Ji ber vê yekê, jimartina RNA pêdivî ye. Bihesibînin ku berevajiya veguheztina berevajî di nav nimûneyên cihêreng de yek e, divê mîqdara cDNA -ya ku hatî wergirtin yek be, û analîza hejmarî dikare berhevdana astên vegotina genên cihêreng di heman mîqdara ARN -ya giştî de nîşan bide. Dema ku PCR -ya hejmarî ya fluorescence ya têkildar pêk tê, dibe ku cDNA -ya hejmarî piştî veguheztina berevajî ne hewce be ji ber ku genê referansa navxweyî dikare wekî referans tevbigere.

Ew bi gelemperî bi genan re têkildar e, û veguheztina berevajî ya perçeyek dirêj ji bo pir genan ne gengaz e. Ya yekem, karîgeriya veguheztina berevajî ji ya PCR pir kêmtir e. Ya duyemîn, herêma dewlemend a GC û avahiya duyemîn a gelek genan hem transkrîpsiyona berevajî hem jî PCR sînordar dike. Di dawiyê de, dilsozî û bihêzbûna PCR -ê dijwar e ku meriv di heman demê de garantî bike. Di pêvajoya veguheztina berevajî de, kes nikare misoger bike ku ji bo genên kêm kopî, nemaze bi karanîna oligo dT, perçeyek dirêj bistîne. Ji bo 5 'UTR bi GC bêtir, ew hîn dijwartir e. Ji ber vê yekê, ew hîn jî rêgezek maqûl e ku meriv paşnavê bi pêşgirên bêserûber paşve bixe, deverên perçebûna xwezayî di perçeya mebestê de bibîne, bi perçeyan zêde bike, û dûv re vesazkirin û girêdankirina sînorkirinê bike. Bi gelemperî, dijwar e ku meriv yekser perçeyên ji 2 kb mezintir zêde bike, lê her gav ne mumkun e ku meriv wiya bistîne: 1. Berî her tiştî, yekbûna RNA/mRNA garantî bike, û derxistina TRIZOL tê tercîh kirin. 2.M-MLV RT-PCR kit dikare rasterast were bikar anîn. Di pêvajoya amplifikasyonê de dema vebirinê dirêj bikin û hejmara çerxê bi rêkûpêk zêde bikin. Bi alternatîfî, PCR -a hêşînkirî dikare were sepandin, an yek an du reaksiyonan pêşî bi denaturasyon û dirêjkirina guncan a dirêjkirî berî amplifikasyona PCR ya normal pêk bîne, ku dibe alîkar ku dirêjkirina perçeyan. Bala xwe bidin dilsoziya polymerase. 3. Long Taq dikare di PCR -ê de were bikar anîn da ku encamên îdeal bistînin. 4. Ji bo serîlêdana vegotina proteînê, divê polîmeraza dilsoziya bilind were sepandin.

Du celeb veguheztina berevajî hene ku ji hêla TIANGEN ve têne pêşkêş kirin: Quant/King RTase û TIANScript M-MLV. Cûdahiya sereke di navbera wan de mîqdara têketina şablonan e. Quant transkrîptazek berevajî ya bêhempa ye, ku ji M-MLV-ya ku bi gelemperî tê bikar anîn ji vîrûsa leukemiya murîn a Moloney cuda ye cuda ye. Quant transkrîptazek berevajî ya bi kêrhatî ya nû ye ku ji hêla endezyariya Escherichia coli ve bi rengek nûvebar ve hatî vegotin. Quant ji bo zêdekirina 50 ng-2 μg RNA bi çalakiya veguheztina berevajî ya bilind û hilberîna bilind re guncan e. Li gorî MMLV an AMV -ya gelemperî, taybetmendiya herî mezin a Quant ev e ku ew bi şablonên RNA -yê re pêwendiyek pir xurt heye û dikare bêyî denaturasyona germahiya bilind şablonên tevlihev ên veguhezînê berevajî bike. Ji bo şablonên bi naveroka GC -ya bilind, berevajiya berevajî bilindtir e. Lêbelê, ev veguheztina berevajî çalakiya RNase H heye, ku dibe ku bandorê li dirêjahiya hilbera cDNA bike (ji bo şablonên <4.5 kb guncan e). Ji bo veguheztina berevajî ya kevneşopî, veguheztina berevajî ya TIANScript MMLV tê pêşniyar kirin. Ev RTase enzîmanek guhezkirî ye ku bi çalakiya RNase H pir lawaz e, ku ji bo senteza cDNA -ya dirêj (> 5 kb) maqûl e.

Veguheztina berevajî ya yek-gav û zexmkirina PCR-ê di heman lûleyê de bêyî vekirina pêça lûleyê di navbera sentez û cûrbecûrkirina cDNA de, ku ji bo kêmkirina enfeksiyonê alîkar e, têne qedandin. Ji ber ku hemî nimûneyên cDNA -yên ku hatine wergirtin ji bo zêdekirinê têne bikar anîn, hestiyarî pirtir e, bi kêmî ve 0.01 pg ji ARN ya tevayî. Ji bo RTPCR-a yek-gav serketî, destpêkerên gen-taybetî bi gelemperî ji bo destpêkirina senteza cDNA têne bikar anîn. Rêbaza du-gavî, ango veguheztina berevajî û bihêzkirina PCR di du gavan de tê meşandin. Yekem transkrîpsiyona berevajî ji şablonek RNA -yê tê girtin da ku cDNA -yê bistîne, û cDNA -ya hatî bidestxistin bi yek an çend reaksiyonên cûda yên PCR -ê re tê kirin. Rêbaza du-gavî dikare oligo (dT) an destpêkên bêserûber bikar bîne da ku rêberiya senteza xeta yekem a cDNA-yê bike, û dikare hemî agahdariya mRNA-yê ji mînakek taybetî veguhezîne berevajî.