TIANSeq mRNA Kitêra Girtinê

Di halê hazir de, teknolojiya verastkirinê ya bi rêjeyek bilind bi piranî li ser bingeha teknolojiya sekinandina nifşê pêşîn e. Ji ber ku dirêjahiya xwendina teknolojiya rêziknameya nifşê pêşîn sînordar e, pêdivî ye ku em rêzika dirêjahiya tevahî li pirtûkxaneyên perçeyên piçûk bişopînin ku rêz bikin. Li gorî hewcedariyên ceribandinên rêzkirinê yên cihêreng, em bi gelemperî rêzika yek-qedandî an veqetandek du-serî hildibijêrin. Niha perçeyên DNA yên pirtûkxaneya rêzenivîsê ya nifşê din bi gelemperî di navbêna 200-800 bp de têne belav kirin.

a) ADN ji hêla kalîteyê ve kêm e û înhîbîtoran dihewîne. Nimûneyên DNA-yên hêja bikar bînin da ku hûn ji astengkirina çalakiya enzîmê dûr bigirin.

b) Dema ku meriv ji bo avakirina pirtûkxaneya DNA-yê rêbaza bê PCR bikar tîne, mîqyasa nimûneya DNA-yê têrê nake. Gava ku têketina DNA-ya perçebûyî ji 50 ng derbas dibe, pêvajoya xebatê ya bê PCR dikare di pêvajoya avakirina pirtûkxaneyê de bi bijartî were meşandin. Ger hejmara nusxeya pirtûkxaneyê pir hindik be ku rasterast were rêzkirin, pirtûkxaneya DNA dikare piştî girêdana adapterê ji hêla PCR ve were zêdekirin.

c) Qirêjiya ARN rê li ber jimartina DNA ya destpêkê ya ne rast vedigire RNA ya RNA dibe ku di pêvajoya paqijkirina DNAya genomîk de hebe, ku dibe ku bibe sedema jimartina ADN ya nerast û barkirina DNA ya têr di dema avakirina pirtûkxaneyê de. RNA dikare bi dermankirina RNase were rakirin.

A-1

a) Parçeyên piçûk (60 bp-120 bp) xuya dibin Parçeyên piçûk bi gelemperî perçeyên adapter an dimer in ku ji hêla adapterê ve hatine çêkirin. Paqijkirina bi pêlên magnetîkî yên Agencourt AMPure XP dikare van perçeyên adapterê bi bandor derxe û qalîteya rêzkirinê misoger bike.

b) Piştî xurtkirina PCR di pirtûkxaneyê de perçeyên mezin xuya dibin Mezinahiya perçeya DNA ya pirtûkxaneyê piştî girêdana adapterê dê bi 120 bp zêde bibe. Ger perçeya DNA -yê piştî girêdana adapterê zêdetirî 120 bp zêde dibe, dibe ku ew ji ber zêdebûna perçê anormal a zêdebûna PCR -ya zêde çêbibe. Kêmkirina jimara PCR -ê dikare rewşê asteng bike.

c) Mezinahiya anormal a perçeyên DNA -yên pirtûkxaneyê piştî girêdana adapterê Dirêjahiya adapterê di vê kîtê de 60 bp ye. Dema ku du dawiya perçeyê bi adapterê ve bêne girêdan, dirêjahî dê tenê 120 bp zêde bibe. Dema ku adapterek din ji ya ku ji hêla vê kitê ve hatî peyda kirin bikar bînin, ji kerema xwe bi peydakar re têkilî daynin da ku agahdariya têkildar wekî dirêjahiya adapter peyda bike. Ji kerema xwe pê ewle bine ku tevgera xebatê û xebitandinê gavên ku di manual de hatine vegotin bişopînin.

d) Mezinahiya perçeya DNA ya neasayî berî girêdana adapter Sedema vê pirsgirêkê dibe ku ji hêla şert û mercên reaksiyonê yên çewt ên di dema perçebûna DNA de çêbibe. Ji bo têketina DNA -ya cûda divê demên bertekên cihê bêne bikar anîn. Ger têketina DNA-yê ji 10 ng zêdetir be, em pêşniyar dikin ku dema reaksiyonê ya 12 hûrdeman wekî dema destpêkirinê ji bo xweşbîniyê hilbijêrin, û mezinahiya perçeyê ku di vê demê de hatî hilberandin bi giranî di navbera 300-500 bp de ye. Bikarhêner dikarin li gorî hewcedariyên xwe 2-4 deqeyan dirêjahiya perçeyên DNA-yê zêde bikin an kêm bikin da ku perçeyên DNA-yê bi mezinahiya hewce xweşbîn bikin.

A-2

a) Dema perçebûnê ne xweşbîn e Ger DNA -ya perçebûyî pir piçûk an pir mezin be, ji kerema xwe serî li Rêbernameyên Hilbijartina Demê Parçebûnê bidin ku di rêwerzê de hatî diyar kirin da ku dema reaksiyonê were destnîşan kirin, û vê xala demê wekî kontrol bikar bînin, pêvek jî saz bikin pergala reaksiyonê ku 3 hûrdeman dirêj bike an kurt bike da ku di dema perçebûnê de verastkirinek rasttir bike.

A-3

Belavbûna mezinahiya anormal a DNA piştî dermankirina perçebûnê

a) Rêbaza qelandina neyînî ya reagenta perçebûnê, an jî reagent piştî qerisînê bi tevahî tevlihev nabe. Reagensa 5 × Parçebûna Enzîmê Mix li ser cemedê bihelînin. Piştî ku hat qelandin, reagentê bi rengek yekalî bi nermî li binê lûleyê tevlihev bikin. Reagent vortex nekin!

b) Nimûneya têketina DNA -yê EDTA an qirêjkerên din dihewîne Kêmbûna iyonên xwê û ajanên kelîtasyonê di pêngava paqijkirina DNAyê de bi taybetî ji bo serketina ezmûnê girîng e. Ger DNA di 1 × TE de bête helandin, ji bo pêkanîna perçebûnê rêbaza ku di talîmatê de hatî peyda kirin bikar bînin. Ger berhevoka EDTA di çareseriyê de ne diyar be, tê pêşniyar kirin ku DNA -yê were paqij kirin û ji bo reaksiyona paşîn wê di ava deyonîzandî de were belav kirin.

c) Kuantîfîkasyona DNAya destpêkî ya nerast Mezinahiya DNAya perçekirî bi mîqdara ketina DNAyê ve ji nêz ve têkildar e. Berî dermankirina perçebûnê, jimartina rastîn a DNA -ya ku bi karanîna Qubit, Picogreen û rêbazên din tê bikar anîn ji bo diyarkirina mîqyasa rastîn a DNA -yê di pergala reaksiyonê de girîng e.

 d) Amadekirina pergala reaksiyonê bi rêwerzan nayê şopandin Amadekirina pergala reaksiyonê ya perçebûyî divê li gorî rêwerzan bi hişkî li ser berfê were meşandin. Ji bo ku bandora çêtirîn were misoger kirin, pêdivî ye ku hemî hêmanên reaksiyonê li ser berfê werin danîn û amadekirina pergala reaksiyonê divê piştî sarbûna bêkêmasî were meşandin. Piştî ku amadekarî qediya, ji kerema xwe felq bikin an pipet bikin da ku bi tevahî tevlihev bibin. Vortex nekin!

1. Rêbaza têkelbûna nerast (vortex, lerizîna tundûtûj, hwd.) Dê bibe sedema belavbûna anormal a perçeyên pirtûkxaneyê (wekî ku di jimara jêrîn de hatî xuyang kirin), bi vî rengî bandor li kalîteya pirtûkxaneyê dike. Ji ber vê yekê, dema ku hûn çareseriya reaksiyonê ya Parçebûna Mix amade dikin, ji kerema xwe bi nermî pipet bikin jor û jêr da ku tevlihev bibin, an serê tiliya xwe bikar bînin da ku hûn bihevre bizeliqînin û tevlihev bikin. Hişyar bin ku hûn bi vortexê re tevlihev nebin.

2. Divê DNAya paqijiya bilind ji bo avakirina pirtûkxaneyê were bikar anîn

Integrity Yekbûna DNA ya baş: Benda elektroforezê ji 30 kb zêdetir e, bêyî dûvikê

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. Pêdivî ye ku mîqdara têketina DNA rast be. Tête pêşniyar kirin ku ji dêvla Nanodrop, ji bo jimartina DNA, rêbazên Qubit û PicoGreen bikar bînin.

4. Divê naveroka EDTA di çareseriya DNA de were destnîşan kirin EDTA bandorek mezin li ser reaksiyona perçebûnê dike. Ger naveroka EDTA bilind be, pêdivî ye ku paqijkirina DNA -yê berî ceribandina paşîn were kirin.

5. Çareseriya reaksiyona perçebûnê divê li ser cemedê were amadekirin Pêvajoya perçebûnê ji germahî û dema reaksiyonê (nemaze piştî zêdekirina bihêzker) hesas e. Ji bo ku rastbûna dema reaksiyonê misoger bibe, ji kerema xwe pergala reaksiyonê li ser berfê amade bikin.

6. Dema reaksiyona perçebûnê divê rast be Wexta berteka pêngava perçebûnê dê rasterast bandorê li mezinahiya perçeyên perçeyê bike, bi vî rengî bandor li mezinahiya perçeyên DNA yên li pirtûkxaneyê bike.

1. Çi celeb nimûneyek li ser vê kîteyê tê sepandin?

Cûreya nimûneya pêkanîn a vê kîtê dikare RNA -ya tevayî an jî mRNA -ya paqijkirî bi yekbûna RNA -ya baş be. Ger ji bo avakirina pirtûkxaneyê ARN ya tevahî were bikar anîn, tê pêşniyar kirin ku kîteya kêmkirina rRNA (Pisik#4992363/4992364/4992391) bikar bînin da ku pêşî rRNA derxînin.

2. Ma nimûneyên FFPE dikarin ji bo avakirina pirtûkxaneyê bi vê kîtekê werin bikar anîn?

MRNA di nimûneyên FFPE -yê de dê bi astek diyarker, bi yekbûna xizan a têkildar, heya radeyekê were xirab kirin. Dema ku hûn vê kitêbê ji bo avakirina pirtûkxaneyê bikar tînin, tê pêşniyar kirin ku dema perçebûnê xweştir bikin (dema perçebûnê kurt bikin an perçebûnê nekin).

3. Bikaranîna pêngava hilbijartina mezinahiya ku di pirtûka hilberê de hatî peyda kirin, gelo çi dibe ku bibe sedema ku beşê têxe navberek piçûktir xuya bike?

Hilbijartina mezinahiyê divê li gorî hişk bi pêngava hilbijartina mezinahiya di vê destana hilberê de were meşandin. Heke devjêberdan hebe, dibe ku sedem ev be ku pêlên magnetîkî di germahiya jûreyê de ne hevseng in an bi tevahî ne tevlihev in, pîpît ne rast e an şilek di serî de maye. Tête pêşniyar kirin ku ji bo ezmûnê serişteyên bi adsorption kêm bikar bînin.

4. Hilbijartina adapteran di avakirina pirtûkxaneyê de

Pirtûka çêkirina pirtûkxaneyê reagentê adapterê nagire, û tê pêşniyar kirin ku hûn vê kitêbê bi Adapterê Yek-Indeksa TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378) bi hev re bikar bînin.

5. QC ya pirtûkxaneyê

Tespîtkirina hejmarî ya pirtûkxaneyê: Qubit û qPCR ji bo destnîşankirina berhevoka girseyî û mezinahiya molarê pirtûkxaneyê bi rêzdarî têne bikar anîn. Operasyon bi hişkî li gorî manuala hilberê ye. Hûrbûna pirtûkxaneyê bi gelemperî dê hewcedariyên rêzkirina NGS bicîh bîne. Danasîna qada belavkirina pirtûkxaneyê: Bikaranîna Agilent 2100 Bioanalyzer ji bo tespîtkirina qada belavkirina pirtûkxaneyê.

6. Hilbijartina jimara dewreya amplifikasyonê

Li gorî talîmatan, jimara PCR-ê 6-12 e, û divê jimareyên PCR-ên ku hewce ne li gorî têketina nimûneyê bêne hilbijartin. Di pirtûkxaneyên bi hilberîna bilind de, zêdebûn bi gelemperî di dereceyên cihêreng de çêdibe, ku ev yeka hanê bi leza piçûktir piştî leza hedefê di tespîtkirina Agilent 2100 Bioanalyzer de tête xuyang kirin, an berhevoka tesbîtkirî ya Qubit ji ya qPCR kêmtir e. Zêdebûna nerm fenomenek normal e, ku bandorê li rêzkirina pirtûkxaneyê û analîzên daneyê yên paşîn nake.

7. Spikes di profîla tespîtkirina Agilent 2100 Bioanalyzer de xuya dike

Xuyabûna pêlên di tespîta Bioanalyzer a Agilent 2100 de ji ber perçebûna newekhev a mînakan e, ku dê di mezinahiya diyarkirî de pirtir perçe hebin, û ev ê piştî zengînkirina PCR zelaltir bibe. Di vê rewşê de, tê pêşniyar kirin ku vebijarka mezinahiyê neyê kirin, ango şertê perçebûnê li 94 ° C bixin 15 hûrdeman ku tê inkubasyon kirin, li cihê ku dabeşkirina perçeyê piçûktir û komkirî ye, û homojen dikare baştir bibe.