Kitêba Mutagenesîs a Serhêl a Malperê

A-1 pablon

■ Di şablonê de qirêjiyên proteînê an astengkerên Taq, û hwd hene. —— lateablona DNA paqij bikin, qirêjiyên proteînê rakin an DNA şablonê bi kîtên paqijkirinê derxînin.

■ Denaturkirina şablonê ne temam e —— Bi guncanî germahiya denaturasyonê zêde bike û dema denaturationê dirêj bike.

Deg Xerabkirina şablonê —— theablon ji nû ve amade bikin.

A-2 Destpêk

Quality Kalîteya nebaş a destpêkan-—Pêşînokê ji nû ve sentez bikin.

Deg Hilweşîna seretayî —— Ji bo parastinê serekên berhevkirî yên bilind bihejmêrin. Ji cemidandin û cemidandina pirjimar an jî dirêj-dirêj 4 ° C sarincokê biparêzin.

Design Sêwirana ne rast a destpêkan (mînak. Dirêjahiya destpêkerê têrê nake, dimer di navbera destpêkan de çêdibe, hwd.)

A-3 Mg²⁺lisersekinî

■ Mg²⁺ konsantrasyon pir kêm e - —Bi rast Mg zêde bikin²⁺ konsantrasyon: Mg Optimize bikin²⁺ kombûna bi rêze reaksiyonên ji 1 mM heta 3 mM bi navberek 0.5 mM ji bo diyarkirina Mg ya çêtirîn²⁺ berhevkirina ji bo her şablon û destpêk.

A-4 Germahiya Annealing

Temperature Germahiya bilind alandinê bandorê li girêdana destpêk û şablonê dike. —— Germahiya anînê kêm bikin û bi germahiyek 2 ° C şertê xweş bikin.

A-5 Dema dirêjkirinê

Extension Demjimêra dirêjkirina kurt —— Dema dirêjkirinê zêde bikin.

Fenomen: Nimûneyên neyînî jî bendên rêzika hedef nîşan didin.

A-1 Qirêjiya PCR

Cont Qirêjiya rêzika hedef an hilberên zêdekirinê —— Bi baldarî nimûneya ku tê de rêzika armancê di mînaka neyînî de tê pîp kirin an wan ji lûleya santrîfûjê dernexe. Pêdivî ye ku reaktîv an alav werin autoklav kirin da ku asîdên nukleîk ên heyî ji holê rakin, û divê hebûna enfeksiyonê bi ceribandinên kontrola neyînî were destnîşan kirin.

Cont Qirêjiya reaksiyonê —— Reagentan hilînin û li germahiyek nizm hilînin.

A-2 Serokwezîrr

■ Mg²⁺ konsantrasyon pir kêm e - —Bi rast Mg zêde bikin²⁺ konsantrasyon: Mg Optimize bikin²⁺ kombûna bi rêze reaksiyonên ji 1 mM heta 3 mM bi navberek 0.5 mM ji bo diyarkirina Mg ya çêtirîn²⁺ berhevkirina ji bo her şablon û destpêk.

Design Sêwirana seretayî ya nerast, û rêzika armanc bi rêzika ne-hedef re homolojî heye. —— Serenavên ji nû ve sêwirandin.

Fenomena: Zencîreyên bihêzkirina PCR-ê bi mezinahiya ku tê hêvî kirin re nakok in, an mezin an piçûk, an carinan hem bandên zêdebûnê yên taybetî û hem jî bandên bihêzbûnê yên ne-taybetî çêdibin.

A-1 Destpêk

. Taybetmendiya seretayî ya belengaz

—— Serenavê ji nû ve sêwirandin.

Concentration Berhevkirina seretayî pir zêde ye ——Bi rast germahiya denaturasyonê zêde bikin û dema denaturationê dirêj bikin.

A-2 Mg²⁺ lisersekinî

■ The Mg²⁺ konsantrasyon pir zêde ye —— Bi rast Mîqdara Mg2+ kêm bikin: Mg xweş bikin²⁺ kombûna bi rêze reaksiyonên ji 1 mM heta 3 mM bi navberek 0.5 mM ji bo diyarkirina Mg ya çêtirîn²⁺ berhevkirina ji bo her şablon û destpêk.

A-3 Thermostable polymerase

Amount Hejmara zêde ya enzîmê —— Mêjera enzîmê bi rêkûpêk bi navberên 0.5 U kêm bikin.

A-4 Germahiya Annealing

Temperature Germahiya germkirinê pir nizm e —— Bi guncanî germahiya germkirinê zêde bikin an jî rêbaza vekirina du-qonaxî bicîh bînin

Çerxên A-5 PCR

Many Zêde dewreyên PCR —— Hejmara dewreyên PCR kêm bikin.

A-1 Destpêk—— Taybetmendiya belengaz —— Destpêkê ji nû ve dîzayn bikin, cîh û dirêjahiya pêşîn biguhezînin ku taybetmendiya wê zêde bikin; an PCR -a hêlînkirî pêk bînin.

A-2 Temablon DNA

—— tempablon ne paqij e —— lateablon paqij bikin an DNA bi kîtên paqijkirinê derxînin.

A-3 Mg²⁺ lisersekinî

——Mg²⁺ konsantrasyon pir zêde ye —— Bi rast Mg kêm bikin²⁺ konsantrasyon: Mg Optimize bikin²⁺ kombûna bi rêze reaksiyonên ji 1 mM heta 3 mM bi navberek 0.5 mM ji bo diyarkirina Mg ya çêtirîn²⁺ berhevkirina ji bo her şablon û destpêk.

A-4 dNTP

—— Kêmasiya dNTP -ê pir zêde ye —— Kêmasiya dNTP -ê bi guncan kêm bikin

A-5 Germahiya germkirinê

—— Germahiya vezelînê pir nizm —— Bi awayekî guncaw germahiya vezelînê zêde bikin

Çerxên A-6

—— Pir dewr —— Hejmara dewrê xweş bike

Gava yekem ev e ku hûn polîmeraza guncan hilbijêrin. Polîmeraza Taqê ya birêkûpêk ji ber nebûna çalakiya 3'-5 'exonukleazê nikare rast bike, û hevnegirî dê bandorkeriya dirêjkirina perçeyan pir kêm bike. Ji ber vê yekê, polîmeraza birêkûpêk a Taq nikare perçeyên armancê yên ji 5 kb mezintir bi bandor zêde bike. Polîmeraza Taq a bi guheztina taybetî an polimeraza din a dilsoziya bilind divê were hilbijartin da ku karîgeriya dirêjkirinê baştir bike û hewcedariyên amplifikasyona perçeyek dirêj bicîh bîne. Digel vê yekê, zêdekirina perçeyên dirêj jî pêdivî bi sererastkirina sêwirana seretayî, dema denaturation, dema dirêjkirinê, pH tampon, hwd. Ji bo ku pêşî li zirara şablonê were girtin, divê demjimêra guherînê di 94 ° C de ji bo çerxekê 30 sec an kêmtir were kêm kirin, û dema ku germahî heya 94 ° C berî zexmkirinê divê ji 1 min kêmtir be. Wekî din, sazkirina germahiya dirêjkirinê li dor 68 ° C û sêwirandina dema dirêjkirinê li gorî rêjeya 1 kb/min dikare amplifikasyona bi bandor a perçeyên dirêj misoger bike.

Rêjeya çewtiya zêdebûna PCR dikare bi karanîna polimerazên cihêreng ên DNA -yê bi dilsoziyek bilind were kêm kirin. Di nav hemî polimerazên Taq DNA yên ku heya nuha hatine dîtin de, enzima Pfu rêjeya xeletiya herî kêm û dilsoziya herî zêde heye (li tabloya pêvekirî binêre). Digel vebijarka enzîmê, lêkolîner dikarin bi xweşkirina şert û mercên reaksiyonê, rêjeya mutasyona PCR jî kêm bikin, di nav de xweşbînkirina berhevoka tampon, giraniya polîmeraza thermostable û xweşkirina jimara PCR.